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混凝土教学会议版面格式

 

 

 

 

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2010                              烟台大学学报(自然科学与工程版)                                 2010

23                Journal of Yantai University ( Natural Science and Engineering Edition )                       Vol.23 Sup.

 


黄芪多糖对大西洋牙鲆的免疫影响(二号黑体居中)

(空一行)

 英,王淑娴,叶海斌,盖春雷,李天保(四号楷体)

(山东省海水养殖研究所,山东省海水养殖病害防治重点实验室,山东 青岛  266002) (小五号仿宋)

 

摘要:(小五号宋体加粗,变扁)不同剂量(0.20.40.8mg多糖/g鱼体重)黄芪多糖溶液隔日灌服4(500μL/),研究对大西洋牙鲆的免疫影响。第15253555d尾部静脉采血测定NBT阳性细胞比例、免疫球蛋白含量、碱性磷酸酶、超氧化物歧化酶活性及补体C3含量。NBT阳性细胞在灌服后第35d0.8 mg/g鱼体重组比例最高,达24.7%AKPSOD活性和免疫球蛋白含量在灌服后第25d0.8 mg/g鱼体重组水平最高,分别为71.47U/L45.8U/mL49.4g/L;灌服后第25d0.4mg/g鱼体重组补体C3含量最高,为0.65g/L。各检测因子与对照组之间差异显著 (P<0.05),其峰值的出现与多糖作用时间和灌服剂量之间都存在相应绩效关系。( 小五号楷体,变扁)

关键词:(小五号宋体加粗,变扁)黄芪多糖,大西洋牙鲆,免疫系统( 小五号楷体,变扁)

 

黄芪(Astragalus membranaceus),别名箭芪、绵芪等,为常用的中草药,药用价值广泛。大分子化合物黄芪多糖(Astragalus polysaccharides, APS)是从黄芪中提取出来的一种生物活性多糖,是其主要活性物质之一,其化学免疫作用已被研究[1]。近年来,国内外对生物活性多糖作为免疫增强剂的研究较为深入,各种多糖的免疫促进作用已得到试验证实[2~4],黄芪的作用疗效也被研究者和养殖者们重视[5,6]。经过大量的化学结构和药理分析,黄芪多糖的应用研究已经广泛开展,但试验对象大多为小鼠等哺乳动物,其在水产动物上的应用研究还较少。为扩展黄芪多糖在水产养殖中的应用,发挥它对水产动物的免疫影响,本文确定黄芪多糖为研究对象,大西洋牙鲆(Paralichthys dentatus)为试验材料,初步研究黄芪多糖对大西洋牙鲆免疫功能的促进作用,以待开发出更好的无公害的新型渔药或免疫增强剂。( 小五号宋体,变扁)

 

1  材料与方法(小四号宋体加粗,变扁)

1.1材料(小五号宋体加粗,变扁)

黄芪多糖提取物含多糖15%,由亚康药业提供,用无菌生理盐水配制成不同浓度溶液(0.4, 0.8, 1.6mg/mL),沸水浴5min;大西洋牙鲆来自本所鳌山实验基地,平均体重100g;饲料购自青岛金海力公司的鱼用颗粒饲料;瑞氏染料(Wright stain)和吉姆萨染料(Giemsa stain)购自Amresco公司;氯化硝基四氮唑兰(Nirtp Blue TetrazoliumNBT)来自Chem Base公司;肝素钠购于上海蓝季科技发展有限公司;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)试剂盒购于南京建成生物工程研究所,补体C3试剂盒购于浙江伊利康生物技术有限公司,其他试剂均为化学分析纯。( 小五号宋体,变扁)

1.2条件

大西洋牙鲆于饲养于圆形玻璃钢桶(直径65cm,高65cm)内,每只桶内12条,定量投喂,暂养7d后用于试验;水温19~25℃pH7.8,间歇充气(开10min5min),每日排污、换水,换水量1/2,自然光照(室内)。

1.3试验设计

多糖接种方式为灌服,每隔1d灌服1(500μL),共4次;试验分4组(空白对照;第123组分别为0.20.40.8 mg/g);每组3个平行,每个平行4条牙鲆;设重复试验。

1.4 取样

灌服后第15253555d尾部静脉采血(大西洋牙鲆重复使用),一部分直接装入EP管制备血清(室温放置1~2h4℃过夜, 5000r/min离心15min,收集血清-20℃保存备用);一部分用1%肝素钠抗凝,4℃保存备用。

1.5 NBT应用液的制备

NBT用无菌生理盐水配制成2g/L的水溶液,室温下搅拌1h使之完全溶解,过滤,滤液要呈透明的淡黄色存于棕色瓶中。试验前取NBT水溶液与等量的0.067mol/L的磷酸盐缓冲液(pH6.4)混合,即为NBT应用液。此溶液现配现用。

1.6 NBT阳性细胞的测定

0.2mL抗凝血和0.2mL 2g/L NBT应用液于试管中混匀,37℃温育30min,中间振摇一次,移至室温下放置15min,混匀,吸取1滴于载玻片上做成推片,立即吹干,先用Wright染液固定30-60s,再用约1.5Giemsa染液覆盖,轻轻摇动至混合均匀,室温静置10min;用蒸馏水冲洗。冲洗时应将玻璃片持平,洗后斜置干燥,油镜检测,细胞被染成深紫色或深蓝色为NBT阳性细胞。计录一个视野内NBT阳性细胞百分数。

1.7免疫球蛋白含量测定

100μL血清中加等量12%PEG10000KD)溶液,室温23℃振荡2h3000r/min离心15min,处理后血清中蛋白的减少量定义为免疫球蛋白总量,蛋白含量采用Bradford考马斯亮蓝法测定。

1.8 酶活性测定

SODAKP活性均按照南京建成试剂盒方法测定。SOD活性按照T-SOD方法测定,每毫升反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位(U)AKP活性单位定义为100ml血清在37℃与基质作用15 min产生1mg酚为1个金氏单位(1金氏单位=7.14U/L)。补体C3含量同样按照试剂盒方法测定,单位为g/L

1.9 数据处理

对所得数据利用软件SPSS 11.5进行分析,P<0.05水平为显著性差异。

 

2  结果

2.1  NBT阳性细胞比例

1为灌服黄芪多糖后大西洋牙鲆血液中NBT阳性细胞数量的变化。从图1中可看出,灌服后第25d各试验组与对照产生明显差异(P <0.05),呈增强趋势,第35d 0.8mg APS/g鱼体重组达最高,阳性细胞数占24.7%APS对大西洋牙鲆的细胞免疫存在显著效应。Duncana分析得出,各试验组与对照组存在显著性差异(P <0.05)

2.2  免疫球蛋白含量

黄芪多糖对大西洋牙鲆血清中免疫球蛋白含量的影响如图2所示。灌服后第25d各试验组与对照产生显著差异(P <0.05),尤以0.8mg /g组效果最好,达到49.4g/L;在第3555d各试验组较第25d都有所下降,与对照差异不显著(P >0.05)


 

1 黄芪多糖对NBT阳性细胞的影响(小五黑体)

Fig.1 Effect of APS on NBT cell (小五TimesNew Roman

  

2 黄芪多糖对免疫球蛋白总含量的影响

Fig.2 Effect of APS on total immunoglobulin contents


2.3  AKP活性

3为灌服黄芪多糖后大西洋牙鲆血清中AKP活性变化。从图3中可以看出,灌服APS后第15d 0.40.8mg /gAKP活性即明显增加,与对照差异性显著(P <0.05);第25d 0.4mg /g组最高(71.47U/L),较对照组提高了4倍;随后又呈下降趋势。

2.4  SOD活性

黄芪多糖对大西洋牙鲆血清中SOD活性的影响如图4所示。灌服后第25d各试验组都呈增强趋势,以0.8mg /g剂量组差异性最显著(P<0.05),达到45.8U/mL,比对照提高40.5%;第55d各组之间不存在显著差异(P>0.05)

3 黄芪多糖对大西洋牙鲆血清中AKP活性的影响

Fig.3  Effect of APS on AKP activities in the serum of Paralichthys dentatus


2.5  补体C3含量

5为灌服黄芪多糖后大西洋牙鲆血清中补体C3含量的变化。从图5中看出,灌服后第25d补体C3含量出现显著增加,以0.4mg /g组最高,为0.65g/L,比对照组提高了2倍;第3555d同样出现下降趋势,第55d试验组与对照之间差异性不显著(P>0.05)


4  黄芪多糖对刺参体腔液中SOD活性的影响

Fig.4  Effect of APS on SOD activities in the serum of Paralichthys dentatus

5黄芪多糖对大西洋牙鲆血清中补体C3含量的影响

Fig.5  Effect of APS on C3 contents in the serum of Paralichthys dentatus


3  讨 论

APS是一种常用的中草药,可从多方面提高机体免疫力。Sun et al[5]研究APS对仿刺参体腔细胞的影响时发现,APS可显著增加其体腔内细胞吞噬活力和O2-的产生,并且在温度从18℃升高到25℃时呈现不同差异。Yin et al[7]研究发现饲料中添加黄芪量达0.1%和0.5%可显著提高罗非鱼(tilapia, Oreochromis nilotieus)血清溶菌酶的活性。刘红柏等[8]采用灌服的方法研究黄芪对史氏鲟(Acipenser schrencki)的抗氧化能力及免疫力的影响,结果表明黄芪能够对抗氧自由基,增强cNOS活性,抑制iNOS表达,促进NO生成,降低机体内MDA含量,提高SODLSZ酶活性等,进一步证明了黄芪多糖的免疫调节作用。Yuan et al[9]通过半定量RT-PCR检测APS对鲤鱼(common carp)前肾、腮及脾内免疫应答基因(白细胞介素、肿瘤坏死因子α、溶解酵素C)表达的影响,结果证实APS对鲤鱼不同器官内细胞因子及免疫相关基因表达存在一定程度的影响。

鱼类体液免疫因子多种多样[10]。血液中NBT阳性细胞数可综合反映吞噬细胞、中性粒细胞、巨噬细胞的水平和功能,是鱼类非特异性免疫指标中的重要因素之一,也可通过该指标来检测细胞呼吸爆发力(O2-产生活力)[11,12]。火村英[13]报道的酵母多糖对鲤鱼(Carpio Linn.)的效果试验中采用一次性注射方式NBT阳性细胞同样短时间内迅速增加,但持续效果不佳,而连续投饵方式则可使其在保持一定水平的基础上持续稳定地上升。本实验采用灌服方式使牙鲆血液中NBT阳性细胞数明显增加,在一个月内出现稳定上升趋势,但未长久持续,说明在实际生产中饲料添加也需要一定的周期性。注射方式出现效果的时间短,误差较大,多糖浓度是制约试验水平、减小误差的关键因素之一。

免疫球蛋白包括抗体和一些未被证实的具有抗体活性的异常免疫球蛋白,以分泌形式存在于血液和其他体液中,鱼类是低等脊椎动物,抗体特异性与哺乳动物相比是有限的。Siwicki[15]首次将鱼类血清中免疫球蛋白含量作为免疫功能评价指标。本试验中免疫球蛋白含量是唯一从特异性免疫水平上反映机体的免疫功能,虽检测方法简单但与对照比较后可反映APS的促进作用。灌服后第25d 0.8mg/g鱼体重剂量组效果最好,达49.4g/L,与对照相比存在显著性差异(P<0.05),随后时间延长含量下降,但基本保持一定水平。László Ardó[16]试验显示,并不是所有动物免疫球蛋白指标都会明显增加,黄芪提取物则没有增加尼罗河罗非鱼(Nile tilapia, Oreochromis niloticus)体液内的免疫球蛋白量。且有其他中草药还可能起到相反作用[17],这种结果可能与动物本身免疫系统及其他体液因子与添加对象的相互作用有关。

AKP/SOD是溶酶体酶的重要组成部分,研究证实从不同水平上直接反映机体免疫变化[18,19]。鱼类补体能够参与并增强体液和细胞介导的非特异性及特异性免疫,维护机体内环境的平衡,提高机体免疫力[20],其中C3是补体系统的关键成分。研究发现,口服酵母多糖能够明显增强补体C3水平,提高宿主非特异性免疫机能[21]。本试验中在灌服后第25d AKPSOD活性以0.8 mg/g鱼体重组增幅最大,达10.01金氏单位/100mL45.8U/mL,补体C3含量以0.4 mg/g鱼体重组最高,为0.65g/L。由于不同的免疫因子是由不同的体液和细胞因子组成,各个非特异性免疫因子对黄芪多糖表现出不同的特定性,出现最高值的时间和剂量组都不同。这种现象在其他研究中也出现过[16]。故评价一种免疫增强剂对某种水产动物的影响应该综合考虑各个不同因素,整体评价,深入研究。

 

参考文献(五号宋体加粗)

[1] 李鹏飞,杜海燕,赵孟春.黄芪多糖的化学和免疫学研究[J].上海畜牧兽医通讯,2005,5:4-6. (小五号宋体)

[2] 叶海斌,朱安成,张涛,.溶藻胶弧菌脂多糖对大菱鲆白细胞吞噬活性的影响[J].齐鲁渔业,2006,23(3):34-35.

[3] 张春晓,麦康森,艾庆辉,.饲料中添加肽聚糖对大黄鱼生长和非特异性免疫力的影响[J].水产学报,2008,32(3):411-416.

[4] 龚全,许国焕,付天玺,.云芝多糖对奥尼罗非鱼生长、血清溶菌酶活性和补体活性的影响[J].淡水渔业,2008,38(1):16-19.

[5] Sun Y X, Jin L J, Wang T T, et al. Polysaccharides from Astragalus membranaceus promote phagocytosis and superoxide anion (O2) production by coelomocytes from sea cucumber Apostichopus japonicus in vitro[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology, 2008, 147(3): 293-298.

[6] Yin G J, L. Ardó, Thompson K.D., et al. Chinese herbs (Astragalus radix and Ganoderma lucidum) enhance immune response of carp, Cyprinus carpio, and protection against Aeromonas hydrophila[J]. Fish & Shellfish Immunology, 2009,26(1):140-145.

[7] Yin G J,Galina Jeney,Timea Racz, et a1.Effect of two Chinese herbs(Astragalus radix and Scutellariaradix)on nonspecific immune response of tilapia, Oreochromis nilotieus[J]. Aquaculture,2006,253:39-47

[8]刘红柏,卢彤岩,张春燕,.黄芪对史氏鲟抗氧化能力及免疫力的影响[J].大连水产学院学报,2006,21(3):231-235.

[9] Yuan C T, Pan X P, Gong Y, et al. Effects of Astragalus polysaccharides (APS) on the expression of immune response genes in head kidney, gill and spleen of the common carp, Cyprinus carpio L.[J]. International Immunopharmacology, 2008,8(1):51-58.

[10]张永安,聂品.鱼类体液免疫因子研究进展[J].水产学报,2000,24(4):376-406.

[11] Siwicki, A., Studnicka, M. The phagocytic ability of neutrophils and serum lysozyme activity inexperimentally infected carp, Cyprinus carpio L[J]. Journal of Fish Biology(Suppl. A), 1987, 31:57-60.

[12] Ai, Q., Mai, K., Zhang, L. et al. Effects of dietary β-1,3-glucan on innate immune response of large yellow croaker, Pseudosciena crocea[J]. Fish & Shellfish Immunology, 2007, 22:394-402.

[13]火村英,周国勤,杜宣.酵母多糖的提取及其对鱼类非特异性免疫功能的影响[J].生物技术,2004,14(3):45-47.

[14]Siwicki A K, Anderson D P. Nonspecific defense mechanisms assay in fish: II. Potential killing activity of neutrophils and macrophages, lysozyme activity in serum and organs and total immunoglobulin level in serum[A]. Disease Diagnosis and Prevention Methods[R]. FAO-project GCP/INT/JPA, IFI Olsztyn, Poland,1993,105-112.

[15] László Ardó, Guojun Yin, Pao Xu et al. Chinese herbs (Astragalus membranaceus and Lonicera japonica) and boron enhance the non-specific immune response of Nile tilapia (Oreochromis niloticus) and resistance against Aeromonas hydrophila[J]. Aquaculture, 2008, 275:26-33.

[16] Kolman, H. The humoral effects of epin in Siberian sturgeon (Acipenser baeri Brandt) [J]. Archives of Polish Fisheries, 2001, 9 (1):61-69.

(空一行)

基金项目: 山东省财政厅科技创新项目  

作者简介:樊英(1980~),女,硕士,实习研究员,主要从事水产动物病害研究。

 

Effect of Polysaccharides of Astragalus membranaceus on Immunology of  Paralichthys dentatus(四号Time New Roman加粗)

 

FAN Ying, LI Tian-bao, GAI Chun-lei(小四号Time New Roman

(Shandong Province Mariculture Research Institute, Shandong Province Key Laboratory for disease control of Mariculture, Qingdao 266002, China) (小五号Time New Roman

 

Abstract(小五号Time New Roman加粗) Effect of diferrent doses of polysaccharides from Astragalus membranaceus (0.2, 0.4,0.8mg APS/g fish body weight) on Paralichthys dentatus were studied by oral perfusion 4 times. The proportion of NBT cell amount, activities of alkaline phosphatase(AKP) , superoxide dismutase(SOD) and contents of complement C3 and total immunoglobulin from its serum were determined in 15,25,35,55 consecutive days after oral perfusion. The results showed that NBT cell amount reached the highest(24.7%) at 0.8 mg/g APS/g fish body weight on the 35th day after oral perfusion; activities of AKP, SOD and contents of total immunoglobulin were the highest(71.47U/ml, 45.8U/ml, 49.4g/L) at 0.8mg/g APS/g fish body weight on the 25th day; contents of complement C3 were the highest (0.65g/L) at 0.4mg/g APS/g fish body weight on the 25th day. There were significant difference (p<0.05) compared with the control group by SPSS, the performance relations existed between the best result and either the action time or the oral perfusion dose. (小五号Time New Roman

Key words Astragalus polysaccharides; Paralichthys dentatus; immunology

 

 

 

 

 

 

 

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